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      人五聚素3(PTX3)酶聯免疫分析(ELISA)操作方法

      更新時間:2018-03-01      瀏覽次數:2000

      人五聚素3PTX3酶聯免疫分析(ELISA)

      試劑盒使用說明書

      本試劑僅供研究使用       目的:本試劑盒用于測定人血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中五聚素3(PTX3)的含量。

       

      實驗原理

      本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本人五聚素3(PTX3)水平。用純化的人五聚素3(PTX3)捕獲抗體包被微孔板,制成固相體,往包被的微孔中依次加入人五聚素3(PTX3),再與HRP標記的檢測抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經過*洗滌后底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人五聚素3(PTX3)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品人五聚素3(PTX3)含量。

       

      試劑盒組成

      試劑盒組成

      48孔配置

      96孔配置

      保存

      說明書

      1份

      1份

       

      封板膜

      2片

      2片

       

      密封袋

      1個

      1個

       

      酶標包被板

      1×48

      1×96

      2-8℃保存

      標準品

      0.3ml×6管

      0.3ml×6管

      2-8℃保存

      酶標試劑

      5 ml×1瓶

      10 ml×1瓶

      2-8℃保存

      樣品稀釋液

      3 ml×1瓶

      6 ml×1瓶

      2-8℃保存

      顯色劑A液

      3 ml×1瓶

      6 ml×1瓶

      2-8℃保存

      顯色劑B液

      3 ml×1瓶

      6 ml×1瓶

      2-8℃保存

      終止液

      3 ml×1瓶

      6 ml×1瓶

      2-8℃保存

      20×濃縮洗滌液

      15ml×1瓶

      25ml×1瓶

      2-8℃保存

      注:標準品濃度依次為:2400、1200、600、300、150、0 pg/mL.

       

      樣本處理及要求

      1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清,保存過程中如出現沉淀,應再次離心。

      2. 血漿:應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應該再次離心。

      3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

      4. 細胞培養上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

      5. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。

      6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但避免反復凍融.

      7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

       

      操作步驟

      • 標準品的加樣:設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;。
      • 加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品zui終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
      • 加酶:每孔加入酶標試劑100μl,空白孔除外。
      • 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。
      • 配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
      • 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。
      • 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘. 
      • 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。
      • 測定:以空白孔調零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

       

      注意事項:

      • 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。
      • 濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。
      • 各步加樣均應使用加樣器,并經常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內,如標本數量多,推薦使用排槍加樣。
      • 請每次測定的同時做標準曲線,做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(n倍)后再測定,計算時請zui后乘以總稀釋倍數(×n×5)。
      • 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
      • 底物請避光保存。
      • 嚴格按照說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
      • 所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
      • 本試劑不同批號組分不得混用。

      10. 如與英文說明書有異,以英文說明書為準。

       

       

       

      計算

      以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,    

      在坐標紙上繪出標準曲線,根據樣品的OD      

      值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋      

      倍數;或用標準物的濃度與OD值計算出標      

      準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值      

      代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋      

      倍數,即為樣品的實際濃度。                  

       

                                                    

       

      (此圖僅供參考)

       

       

       

      試劑盒性能:

      1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上。

      2.批內變異系數與批間變異系數應分別小于10%和15% 。

       

      檢測范圍:                                              

      75 pg/mL - 2400 pg/mL

       

      靈敏度:                                              

      zui低檢測濃度小于10 pg/mL

       

      保存條件及有效期:

      1.試劑盒保存: 2-8。

      2.有效期: 6個月

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