豬輪狀病毒抗體（RV Ab）試劑盒（ELISA）定性檢測

l 本試劑盒用于體外定性檢測血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中豬輪狀病毒抗體（RV Ab）。

l 有效期：6個月

l 保存條件：2-8℃

實驗原理

試劑盒采用間接法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。由于抗體產生量一般比較大，為避免HOOK效應，試劑盒采用兩步法。往預先包被豬輪狀病毒抗體（RV Ab）捕獲抗原的包被微孔中，依次加入標本、陰性和陽性對照，經過溫育并*洗滌，再加入HRP標記的檢測抗體，經過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的豬輪狀病毒抗體（RV Ab）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），判定陰陽性。

樣本處理及要求

1.  血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2.  血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3.  組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4.  細胞培養物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

注：標本溶血會影響后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

需要而未提供的試劑和器材

• 酶標儀（450nm）
• 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
• 37℃恒溫箱
• 蒸餾水或去離子水

試劑盒組成

注意事項

• 嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
• 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
• 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
• 底物顯色液應呈無色或很淺的顏色，已經變藍的底物液不能使用。
• 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。
• 在儲存和溫育時避免強光直接照射。
• 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
• 任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。
• 不能使用過期產品。
• 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。

試劑準備

試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡后方可使用。

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

操作步驟

1.   從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.   設置陰性對照孔、陽性對照孔和樣本孔，陰性、陽新對照孔各加50μL對照品，樣本孔中加入待測樣本50μL，空白孔不加。用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。
3.   棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
4.   除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。
5.   棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.   每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.   每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。

實驗結果計算

1. 陰性對照OD值：小于0.2。

2. 陽性對照OD值：大于0.8。

3、陽性判斷（Cut-Off值）：陰性對照OD值+0.25，樣本OD值大于閾值，判定為陽性，反之，為陰性。